Giardia on iki barmakly içege ýokançlygy, içege ýokançlygy, esasanam içgeçmäniň kliniki alamatlary bolan ýaş çagalarda ýüze çykýan parazit organizmidir.Öň habar berdik, öýjükli G. duodenalis öýjükli oligomerizasiýa meňzeş reseptor 3 (NLRP3) birleşdiriji nukleotidleri işjeňleşdirýär we öýjükden daşary wezikulanyň (EV) sekresiýasy arkaly öýjügiň çişme seslerini kadalaşdyrýar.Şeýle-de bolsa, bu prosese gatnaşýan patogen bilen baglanyşykly on iki barmakly EV (GEV) takyk molekulýar nagyşlary we giardiazda NLRP3 çişmesiniň roly entek düşündirilmeli.
GEV-de rekombinant eukariotik aňlatma plazmidleri pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri guruldy, syçanyň esasy peritoneal makrofaglaryna geçirildi we çişme maksatly molekulanyň kaspasy-1 ölçemek arkaly kesgitlenildi.P20 aňlatma derejesi görkezildi..G. duodenalis alfa-2 we alfa-7.3 giardinler ilkibaşda NLRP3 çişmesini (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], kaspaz-1 we kaspase-1 p20), IL sekresiýasyny ölçemek arkaly kesgitlenildi.1β derejeler, apoptotik menekli belok (ASC) oligomerizasiýa derejesi, we NLRP3 we ASC immunofloresent lokalizasiýasy.G. on iki barmakly içegäniň patogenliginde NLRP3 çişmesiniň roly, soň NLRP3 işjeňleşdirilmegi (NLRP3 bloklanan syçanlar) we beden agramynyň patologiki üýtgemeleri, on iki barmakly parazit ýüki we on iki barmakly dokuma gözegçilik edilýän syçanlar bilen bahalandyryldy.Mundan başga-da, hiardin alfa-2 we alfa-7.3, NLRP3 çişmesiniň üsti bilen IL-1β sekresiýasyny döredýärmi ýa-da ýokdugyny anykladyk we bu molekulalaryň G. duodenalisiň patogenliginde syçanlarda roluny kesgitledik.
Alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri vitroda NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine itergi berýär.Bu p20 kaspaz-1-iň işjeňleşmegine, NLRP3, pro-IL-1β we kaspaz-1 beloklarynyň aňlatma derejesiniň ýokarlanmagyna, IL-1β sekresiýasynyň ep-esli ýokarlanmagyna, ASA tegmilleriniň döremegine sebäp boldy sitoplazma we ASA oligomerizasiýasynyň induksiýasy.NLRP3 çişmesi Penile ýitgisi, G. duodenalisiň syçanlarda ýüze çykýan patogenligini güýçlendirýär.NLRP3 blokirlenen syçanlardan gawage bilen kistler bilen bejerilen syçanlar, trofozitleriň köpelendigini we on iki barmakly içege agyr zeper ýetendigini, nekrotik kriptleriň gysylmagy we şahalanmagy bilen häsiýetlendirilýär.“Vivo” synaglarynda giardinleriň alfa-2 we alfa-7.3 NLRP3 çişmesiniň üsti bilen IL-1β bölünip çykmagyna sebäp bolup biljekdigini, alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri bilen immunizasiýa etmek, syçanjyklarda G. duodenalisiniň patogenligini peseldendigini görkezdi.
Bu gözlegiň netijesi, giardia alfa-2 we alfa-7.3 öý eýesiniň NLRP3 çişmeginiň kadalaşmagyna sebäp bolýandygyny we giardiazyň öňüni almak üçin niýetlenen maksatlar bolan G. duodenalisiň syçanlarda ýokançlygyny azaldýandygyny görkezýär.
Giardia on iki barmakly içegede ýaşaýan we her ýyl 280 million içgeçme bilen giardiaz keseliniň döremegine sebäp bolýan öýjükli protozoan parazitdir, esasanam ösýän ýurtlaryň ýaş çagalarynyň arasynda [1].Adamlar içgi suwundan ýa-da M. on iki barmakly kistalar bilen hapalanan iýmitlerden ýokaşýarlar, soň bolsa aşgazana girýärler we aşgazan şirelerinde çykarylýar.Giardia on iki barmakly trofozitler on iki barmakly epitel bilen birleşýär, ýürek bulanma, gusmak, içgeçme, garyn agyrylary we horlanmaga sebäp bolýar.Immun ýetmezçiligi we kistik fibrozly adamlar ýokançlyga sezewar bolýarlar.Fectokançlyk agyz we anal jyns arkaly hem bolup biler [2].Metronidazol, tinidazol we nitazoksanid ýaly dermanlar on iki barmakly içege ýokanç keselleriniň ileri tutulýan usullarydyr [3].Şeýle-de bolsa, bu himiýa bejergisi ýürek bulanma, kanserogenez we genotoksiklik ýaly ýaramaz täsirleri döredýär [4].Şonuň üçin G. duodenalis ýokançlygynyň öňüni almak üçin has täsirli strategiýalary işläp düzmeli.
Inflammasomlar, dogabitdi immunitetiň bir bölegi bolan sitosoliki belok toplumlarynyň bir topary bolup, patogen hüjüminden goranmaga we çişme täsirlerini ara alyp maslahatlaşmaga kömek edýär [5].Bu ýokançlyklaryň arasynda nukleotid bilen baglanyşdyrýan oligomerizasiýa (NOD) reseptor 3 (NLRP3) nukleotid baglaýjy oligomerizasiýa (NLRP3) nukleotid bilen baglanyşdyrýan çişme giňden öwrenildi, sebäbi dürli patogen / zeper bilen baglanyşykly molekulýar nagyşlar (PAMP / DAMP), dogabitdi immun ulgamyny ykrar edýär, işjeňleşdirýär.we köp çişme kesellerinde içege gomeostazyny kadalaşdyrýar [6,7,8].Ol nagyş tanamak reseptoryndan (PRR) NLRP3, adapter apoptotik tegmilli belokdan (ASC) we effektor prosaspase-1 ýa-da procaspase-11-den ybarat.NLRP3 çişmesi, Neospora kanininde [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] we Leishmania barlaglarynda bolşy ýaly, patogen çozuşyna garşy öý eýesi hökmünde çykyş edýär.]Öňki gözleglerimiziň esasynda, öýjükli G. duodenalisiň NLRP3 çişmesiniň öýjükli işjeňleşmegine sebäp bolýandygyny we öýjükden daşary vesikullary (EV) bölüp, öýjügiň çişme seslerini modullaýandygyny habar berdik [13].Şeýle-de bolsa, G. duodenalis infeksiýasynda NLRP3 çişmesiniň roly kesgitlenmeli.
Giardins ilkibaşda G. duodenalis sitoskeletiniň düzüm bölekleri hökmünde häsiýetlendirilip, trofozit hereketinde we inçe içegede epitel öýjükleriniň birikmeginde möhüm rol oýnaýar.Daşky gurşawa has oňat uýgunlaşmak we olaryň patogenligini ýokarlandyrmak üçin G. duodenalis trophozoites 8 flagella, 1 orta beden we 1 ventral diskden ybarat özboluşly sitoskelet gurluşyny döretdi [14].Giardia on iki barmakly içegäniň trofozitleri sitoskeletini ýokarky içege, esasanam on iki barmakly içege girip, enterositlere birikdirmek üçin ulanýarlar.Öýjükleriň alyş-çalşyny ulanyp, hemişe göçýärler we epitel öýjüklerine birikýärler.Şonuň üçin sitoskelet bilen wirusyň arasynda ýakyn baglanyşyk bar.Giardia on iki barmakly içege üçin niýetlenen jardinler sitoskelet gurluşynyň düzüm bölekleridir we dört klasa bölünýär: α-, β-, γ- we δ-giardinler.Gi-giardin maşgalasynyň 21 agzasy bar, olaryň hemmesiniň fosfolipidleri baglamak üçin kalsiýa bagly ukyby bar [16].Şeýle hem sitoskeleti öýjük membranasyna birikdirýärler.G. duodenalis sebäpli döreýän içgeçme bolan adamlarda α-giardinler ýokaşma wagtynda ýokary derejede ýüze çykýar we immunoreaktiw däl [17].Syçanlarda giardiazdan goralýan Giardia alfa-1 esasly geterologiki sanjymlar we sanjymlary ösdürmek üçin dalaşgär antigenlerdir [18].Plazma membranasynda we flagellada lokallaşdyrylan, ýöne ventral diskde däl Alfa-8 giardin, G. duodenalisdäki trofozitleriň hereketini we ösüş tizligini ýokarlandyrýar [19].Alfa-14 giardin flagelladaky mikrotubula gurluşlaryna birikýär we G. duodenalisiň ýaşaýyş ukybyna täsir edýär [20].Alfa-11 giardine ömrüň dowamynda köp bolýar we alfa-11 giardiniň aşa aşa gysylmagy G. duodenalisiň özüne zyýan ýetirýär [21].Şeýle-de bolsa, alfa-2 giardiniň we alfa-7.3 giardiniň G. duodenalis ýokançlygyndan we olaryň esasy mehanizmlerinden goraýandygy ýa-da ýokdugy belli däl.
Bu gözlegde, öý eýesi NLRP3-i işjeňleşdirmek üçin rekombinant eukariotik aňlatma plazmidi pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin we pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardine syçanjygyň esasy peritoneal makrofaglaryna geçirildi.Soňra inflammasome nyşanlary barlandy.Şeýle hem, G. duodenalisiň patogenliginde NLRP3 çişmesiniň roluna baha berdik, alfa-2 we alfa-7,3 giardinleriň NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine sebäp bolýandygyny ýa-da ýokdugyny anykladyk we giardinleriň bu iki rolunyň patogenliginde kesgitledik; G. duodenalis.Biziň umumy maksadymyz G. duodenalis ýokançlygynyň öňüni almak üçin geljegi uly maksatlary döretmekdi.
Wildabany görnüş (WT) C57BL / 5–8 hepde aralygyndaky 6 aýal syçan, Liaoning Changsheng tejribe haýwan merkezinden (Liaoning, Hytaý) satyn alyndy.Syçanlar suwa erkin elýeterli boldular, sterilizasiýa edilen iýmitleri aldylar we 12/12 sagat ýagtylyk / garaňky aýlawda saklandy.Syçanlar ýokaşmazdan ozal ampisillin (1 mg / mL), wankomisin (1 mg / mL) we neomisin (1,4 mg / mL) (hemmesi Şanhaý, Hytaý, emeli organizmler) bilen doldurylan agyz suwunda antibiotik mahabatyny aldylar [22 ].].24 sagatlap iýip-içmek ukybyny ýitiren we beden agramyny% 20% ýitiren syçanlar, ýatgynyň üýtgemegi bilen adam tarapyndan awtomatlaşdyryldy.
WB G. duodenalis trophozoites (Amerikan görnüşiniň medeni ýygyndysy, Manass, ABŞ) 12,5% düwünçegiň irin serumu (FBS; Her Greenaşyl, Zhejiang, Hytaý) we 0,1% iriňli öt haltasy (Sigma-Aldriç, Sent-Missuri, ABŞ) bilen dolduryldy. ).ABŞ) mikroerob şertlerinde.Garyşyk trofozitler buzda ýygnalyp, has köpeltmek üçin 1: 4 nisbatynda geçirildi.
Giardia on iki barmakly kistalar öň beýan edilişi ýaly ýüze çykaryldy [23], trofozitler logarifmiki fazada ýygnaldy we soňra pH × 7.1 (üýtgedilen TYI-S-33) jemleýji konsentrasiýa bilen 1 × 106 trofozit / ml jemlendi.öt konsentrasiýasy 0,05% orta).Trofozitler, logarifmiki ösüş tapgyryna çenli 37 ° C-de anaerob şertlerde ösdürilip ýetişdirildi.Gurluşy kist induksiýa gurşawyna üýtgediň (pH 7.8; 1% öt konsentrasiýasy bilen üýtgedilen TYI-S-33 gurşawy) we medeniýeti G. duodenalis 37 ° C-den 48–96 sagatlap üýtgediň, şol döwürde mikroskopda emele geliş kistalary synlandy.Trofozitleriň köpüsi kistalary emele getirensoň, medeniýet garyndysy ýygnalyp, galan trofozitleri lizlemek üçin steril deionizirlenen suwda ýerleşdirildi.Syçanlardaky aşgazan turbasynyň üsti bilen soňraky derňewler üçin kistalar sanaldy we 4 ° C derejesinde saklandy.
Giardia öýjükli vesikullar (GEV) öň beýan edilişi ýaly baýlaşdyryldy [13].Logarifmiki ösüş tapgyryndaky trofozitler, ekzosoma-tükenen FBS (Biologiýa senagaty, Beýt-Haemek, Ysraýyl) bilen taýýarlanan üýtgedilen TYI-S-33 gurşawynda gaýtadan işlenip, 1 × 106 parazit / mL jemlenip, 12 sagat inkubasiýa edildi.2000 g 10 minutda sentrifugasiýa, 10 minut 45 minut üçin 100 000 gr we 60 minut üçin 100,000 g merkezden gaçyryş medeniýeti bilen izolýasiýa edildi.Ygalyň ýagy fosfat buferli duzda (PBS) eritildi, BCA belok analiz toplumy (Termo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) ulanylyp, -80 ° C derejesinde saklandy ýa-da göni derňew üçin ulanyldy.
Syçanyň esasy peritoneal makrofaglary öň beýan edilişi ýaly taýýarlandy [24].Gysgaça aýdanyňda, syçanlara (6-8 hepde aralygy) 2,5 ml 2.98% Difco suwuk tioglikol serişdesi (BD, Franklin Lakes, NJ, ABŞ) sanjym edildi (içerde [ip]) we 3-4 aýak iýmitlendi.Makrofaglaryň togtadylmagy, ewtanaziýadan soň syçanlaryň garyn boşlugyndan ýygnalyp, 10 minut üçin 1000 g-da 3 gezek merkezden gaçyryldy.Hasyl ýygnalan öýjükler, CD11b markerini ulanyp, öýjükleriň arassalygy> 98% bolýança, soňra 6 guýy öýjük medeni plitalaryna (4,5 x 106 öýjük / guýy) goşuldy we 37 ° C-de 10% FBS (Bioindustriýa) bilen inkubasiýa edildi.we 5% CO2.
RNK 1 ml TRIzol reagentinde (Wazyme, Nanjing, Hytaý) 1 × 107 trofozitden alyndy, MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Hytaý) ulanyp, genom DNK umumy G. duodenalis RNK-dan alyndy we goşmaça DNK (cDNA) sintez edildi öndürijiniň görkezmesine laýyklykda MonScript RTIIII Super Mix (Monad) ulanmak.
Maksatly G. duodenalis geni üçin CDS yzygiderliligi maglumatlary NCBI GenBank-dan alyndy.Her maksatly gen üçin belli bir bökdençsiz klonlaşdyryş desgalaryny dizaýn etmek üçin Primer 5.0 ulanyň.Öňe sürülýän desga (5′-3 ′) üç bölekden ybarat: çyzykly wektorly pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) bilen biri-birine gabat gelýän yzygiderlilik we ATG we GNN kodlaryny başlamak (birinji bazasy G däl bolsa).Bu aňlatmagyň netijeliligini ýokarlandyrmak üçin edilýär.Mundan başga-da, azyndan 16 at güýji birleşdirilen esaslar (GC mazmuny 40–60% / Tm takmynan 55 ° C).Ters primer (5′-3 ′) iki bölekden ybarat, EcoRV çyzykly wektor pcDNA3.1 (+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) we iň azyndan 16 at güýji birleşdirilen esas.(soňky iki duralgadan başga).esaslar) rekombinant plazmidleriň bellikli beloklaryny görkezmegine rugsat bermek üçin AA ýa-da GA ýaly kodon).Esasy yzygiderlilik 1-nji tablisada görkezilen we Kangmet Biotehnologiýa Co., Ltd. (Çaççun, Hytaý) tarapyndan sintez edildi.
Maksatlar Pfu DNK polimerazyny (Tiangen, Pekin, Hytaý) ýa-da Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Pekin] Co., Ltd., Pekin, Hytaý) şablon hökmünde taýýarlanan G. duodenalis cDNA ulanyp güýçlendirildi.Eukariotik aňlatma wektor plazmid pcDNA3.1 (+) EcoRV çäklendiriji fermenti bilen çyzykly bolup, “Fast AP” (Termo Fisher Scientific) ulanyp deposforirlendi.Çyzykly pcDNA3.1 (+) bölekleri we güýçlendirilen maksatly gen bölekleri DNK jel arassalaýyş toplumy (Tiangen) bilen arassalanyldy we Nanodrop ND-2000 (Termo Fisher Scientific) ulanylyp mukdarda kesgitlenildi.PCDNA3.1 (+) bölegi we her maksatly gen bölegi MonClone ýeke gurnama klonlaşdyryş garyndysy (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Hytaý) bilen birleşdirildi we Comate Bioscience Company Limited (Çançun, Hytaý) ulanyp DNK yzygiderliligi bilen tassyklandy..
Endotoksinsiz plazmidler pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 SanPrep Endotoksinsiz plazmid kiçi toplumyny (Sangon Biotech) ulanyp döredildi.Elitasiýa buferindäki EDTA-nyň transfeksiýa barlagyna päsgel bermezligini üpjün etmek üçin konsentrasiýa 500 ng / µl-dan ýokary saklandy.Ilkinji syçanjygyň peritoneal makrofaglary doly RPMI 1640 orta (Biologiýa senagaty) bilen 6 guýy tarelkede ösdürilip ýetişdirildi, penisillini we streptomisini aýyrmak üçin öýjükler ýyly PBS-de 3 gezek ýuwuldy, soňra bolsa doly gurşaw bilen dolduryldy.Endotoksinsiz plazmidler pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 (2,5 μg) 125 μl Opti-MEM peseldilen serum serişdesinde (Gibco, Termo Fisher Scientific) suwuklandyryldy..Soňra 5 µl Lipofektamin 2000 transfeksiýa reagenti (Invitrogen, Termo Fisher Scientific) 125 µl pes serum Opti-MEM gurşawynda garyndy.Lipofektamin 2000 bilen suwuklandyrylan endotoksinsiz plazmidi garyşdyryp, garyndynyň otag temperaturasynda 5 minut durmagyna ýol açyp, liposoma-DNK toplumlaryny taýýarlaň.Toplumlary her guýynyň öýjüklerine aýratyn geçiriň we haýal garyşyň.4 sagatdan soň öýjük medeniýeti 2 ml doly RPMI 1640 orta çalşyldy we medeniýet 24 sagat dowam etdi.Öýjüklere täze öýjük medeniýeti goşuldy we analiz dizaýnyna baglylykda dürli wagt nokatlary üçin inkubasiýa edildi.
Adatdan daşary hadysalardan we öýjük lizatlaryndan belok nusgalary öň beýan edilişi ýaly taýýarlandy [25].Pro-IL-1β, pro-kaspase-1, kaspase-1 p20, NLRP3, β-aktin we onuň belligi üçin membranany geçiriş parametrleri 200 mA / 90 min.Interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, ABŞ), kaspase-1 (p20) (Adipogen, Şweýsariýa) we NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Şweýsariýa) we belligini nyşana alýan 1: 5000 (Amylet Scientific, Wuhan, Hytaý) we β-aktin (Proteintech, Wuhan, Hytaý).
Disuksinimid suberaty (DSS) bilen kesişmek, öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi [26].Öýjükler sowuk PBS bilen 3 gezek ýuwuldy we 25 mM Na2PO4, 187.5 m NaCl, 25 mM HEPES we 125 mM NaHCO3 bolan 50 µl ASC reaksiýa buferinde (pH 8.0) 27 ölçegli iňňe bilen doly lizelendi.Garyndy 5000 g 3 minutda merkezden gaçyryldy we pellet 10 µl DSS (DMSO-da 25 mM) we 37 ° C-de 30 minut ASC reaksiýa buferi bilen tikildi.5000 g 10 minutda sentrifugadan soň, pellet 40 µl ASC reaksiýa buferiniň we 10 µl 6x belok ýükleýji buferiň (TransGen, Pekin, Hytaý) ergininde eritildi, soň bolsa ergin 15 otag temperaturasynda söndürildi. min., Soňra 10 minut gaýnadyň.Beloklaryň nusgalary soňra 1: 500 nisbatda ASC-e garşy antikorlary (Wanleibio, Şenýan, Hytaý) ulanyp, Günbatar partlamalaryna sezewar edildi.
Öň beýan edilen prosedura [13] laýyklykda öýjük medeniýeti adatdan daşary hadysalar ýygnaldy we IL-1 Beta ELISA toplumy (Invitrogen, Termo Fisher Scientific) ulanyp, çişmä garşy sitokiniň IL-1β sekresiýasy kesgitlenildi.OD450nm bahalaryny IL-1β standart egrini ulanyp, belok konsentrasiýalaryna öwüriň.
Örtükler bilen örtülen öýjükler ýyly PBS-de 3 gezek ýuwaşlyk bilen ýuwuldy, dokumanyň öýjüklerini düzediji (Biosharp, Pekin, Hytaý) otag temperaturasynda (RT) 10 minutda, 0,1% Triton X-Permeabilize 100-de (PBS-de suwuklandyryldy; Biosharp; ) otag temperaturasynda 20 minutlap, 5% iriňli albumini (PBS-de) otag temperaturasynda 2 sagatlap ýapyň.Öýjükler degişlilikde ASC (1: 100 seýreklemek) ýa-da NLRP3 (1: 100 eritme) garşy esasy antikorlary bilen 4 ° C-de inkubasiýa edildi, Cy3 bolsa towşana garşy IgG (H + L) (1: 400; EarthOx) bellik edildi. , San-Fransisko, Kaliforniýa, ABŞ) ýa-da FITC-konýugirlenen geçi syçanjyga garşy IgG (1: 400; Earthox) bir gije 37 ° C-de 1 sagat garaňkylykda.Nucadrolar Hoechst 33258 (10 μg / ml; UE, Suzhou, Hytaý) bilen 5 minut boýaldy we floresan mikroskopda (Olympus Corporation, Tokio, Japanaponiýa) gözegçilik edildi.
Syçanlar dört topara bölündi (her toparda n = 7): (i) PBS bilen bejerilýän otrisatel gözegçilik topary (diňe PBS; gavage 100 µl / syçan PBS, soň bolsa gündelik içerki sanjym 100 µl / syçan PBS 3 sagat soň)., yzygiderli 7 gün);.(iii) Г..Her syçanjygyň beden agramyna her gün gözegçilik edilýärdi we 7-nji günde ähli syçanlar awtomatlaşdyryldy.Hasyl ýygnalan on iki barmakly içege (uzynlygy 3 sm) 1 ml PBS-de ownuk böleklere bölünipdi, kistalar bir gije 4 ° C-de we G. duodenalis trofozitler bilen ýok edildi.Gematoksilin we eozin (H&E) boýag üçin täze on iki barmakly (uzynlygy 1 sm) izolirlendi.
Syçanlar iki topara bölündi: (i) MOKK gözegçilik topary we (ii) MCC950 inhibitor topary.Her toparda bäş sany bejergi bardy (n = 7 / bejeriş topary): (i) PBS bejergisiniň negatiw gözegçilik topary (diňe PBS; 100 µl / syçan PBS, öýjükli (IM) sanjym (tibialis anterior) [28, 29]; ( ii) pcDNA3.1 (+) plazmid otrisatel gözegçilik topary (öýjükli sanjym arkaly 100 µg / syçanyň DNK) (iii) G. duodenalis kist ýokançlygynyň oňyn gözegçilik topary (1,5 x 106 kist / syçan, gawage arkaly) (iv) a; plazma pcDNA3.1 (+) - alfa-2 (100 μg / syçan DNK, öýjükli sanjym bilen) we (v) plazma pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 (100 µg / syçan) bilen bejerilen topar DNK, 12 sagat geçenden soň, MCC950 inhibitor toparyndaky syçanlar her gün MCC950 (10 mg / kg beden agramy) içerki sanjymyny aldylar, MOCK toparyndaky syçanlar bolsa deň mukdarda PBS bejergisini aldylar. Gan nusgalary Göz gabaklaryndan ýygnanan we bir gije 4 ° C derejesinde goýlan Serum nusgalary ferment bilen baglanyşykly immunosorbent barlagy (ELISA) we IL-1β derejelerini ölçemek üçin izolirlendi.
Otuz bäş syçan bäş topara bölündi (n = 7 / topar).1-nji topar PBS bilen bejergi alýan negatiw gözegçilik toparydy: syçanlar 100 μl PBS öýjükli we 3 gün soň bolsa gawage aldy.2-nji topar G. duodenalis kistalary bilen ýokaşan oňyn gözegçilik toparydyr: syçanlara 100 μl PBS sanjym edildi, 3 günden soň bolsa 1,5 x 106 kista / syçanjyga intragastriki sanjym edildi.Üçünji topar - on iki barmakly kist infeksiýasyna gözegçilik topary bilen bilelikde pcDNA3.1 (+) bilen plazma immunizasiýa: syçanlar dilden 100 μg plazmaid DNK pcDNA3.1 (+) (im) aldylar, birnäçe üçin 1,5 × 106 kist / syçan 3 günler.4-nji we 5-nji toparlar rekombinant pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin plazmidi ýa-da pcDNA3.1 (+) - G. duodenalis kist ýokançlygy bilen bilelikde alfa-7.3 giardin plazmidi.Synag topary: syçanlar 100 µg pcDNA3 aldy.1 (+) - giardin plazmid DNK (im), soň 3 günden soň gawage arkaly 1,5 × 106 kista / syçan sanjym edildi.G. duodenalis kistasynyň turba arkaly girizilmeginden soň her syçanjygyň beden agramyna gözegçilik edildi.Parazitiki ýük ölçegleri we HE boýag derňewi üçin täze on iki barmakly içege ýygnaldy.
Gistopatologiki üýtgeşmeler ozal neşir edilen prosedura laýyklykda seljerildi [30].Täze on iki barmakly içege dokumanyň öýjüklerini düzediji, parafine salynýan, 4 mk bölüme bölünen, H&E bilen reňklenen we ýeňil mikroskop astynda analiz edildi.Sevenedi garaşsyz syçanjygyň ýedi dokuma bölümindäki wekilçilikli patologiki üýtgemeler, bejergiden bihabar patolog tarapyndan baha berildi we 200x ulalanda ele alyndy.Villiniň uzynlygy we kriptleriň çuňlugy öň beýan edilen usullara laýyklykda ölçeldi.
Witro we in vivo netijeleri üçlükde alyndy.Grafalar GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABŞ) ulanyp döredildi.Iki toparyň arasyndaky tapawutlar t-test arkaly seljerildi, groups3 toparyň arasyndaky tapawutlar SPSS programma üpjünçiligini (22.0 wersiýa; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ABŞ) ulanyp, birtaraplaýyn seljerme (ANOVA) arkaly seljerildi.Leweniň synagyndan soň Bonferroniniň soňky synagy (B) ulanyp, birmeňzeşlik üçin maglumatlar seljerildi.Möhümi P <0.05, P <0.01, we P <0,001 (ähmiýetli däl [ns]) (P> 0.05) görnüşinde aňladylýar.
Genleriň we genleriň Kýoto ensiklopediýasynda (KEGG) GEV proteomikasyny öňki seljerişimiz, çişiriji signalizasiýa ýollarynyň işjeňleşmegine köp nyşanyň gatnaşyp biljekdigini görkezdi [13].Iki sany geljegi uly nyşany saýladyk, alfa-2 we alfa-7.3 giardin, bu molekulalary güýçlendirýäris we pcDNA3.1 (+) eukariotik aňlatma wektoryny gurmak üçin ulanýarys.Yzygiderlilikden soň, rekombinant pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we alfa-7.3 giardin aňlatma plazmidi syçanjygyň esasy peritoneal makrofaglaryna geçirildi we çişmegiň kaspase-1 p20 gol belogy (işjeňleşdirilen kasp-1 bölegi) kesgitlenildi. çişmegine sebäp bolup biljek esasy molekulalary düşündirmek hökmünde.Netijeler, alfa-2 we alfa-7.3 giardinleriniň GEV-e meňzeş p20 kaspaz-1 aňlatmasyny döredip biljekdigini görkezdi.Bejerilmedik negatiw gözegçilikde (diňe PBS) we plazma gözegçilik pcDNA3.1 (+) -de kasp-1 işjeňleşdirilmegine hiç hili täsir tapylmady (1-nji surat).
P20 kaspase-1 işjeňleşdirmesini pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri bilen ölçemek.Rekombinant eukariotik aňlatma plazmidi pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri (her zolagyň ýokarsynda) esasy syçanjygyň peritoneal makrofaglaryna geçirildi we medeniýet adatdan daşary tebigatlary 24 sagatdan soň ýygnaldy.Günbatar blotting, kaspaz-1 p20 çişme belogynyň gol derejesini aňlatmak üçin ulanyldy.Negativearamaz gözegçilik hökmünde diňe PBS bejeriş topary (C zolagy) we pcDNA3.1 (+) monoterapiýa topary (pcDNA3.1 zolak) ulanyldy, oňyn gözegçilik hökmünde GEV bejeriş topary ulanyldy.Rekombinant belogynyň beýany, her bir belokda histidin belligini kesgitlemek bilen tassyklandy we garaşylýan belok zolaklary alfa-2 giardin (38.2 kDa) we alfa-7.3 giardin (37.2 kDa) boldy.GEV, Giardia on iki barmakly öýjükli vesikullar, pcDNA3.1 (+), EcoRV çyzykly wektor, SUP, adatdan daşary
Alfa-2 giardiniň we alfa-7.3 giardiniň p20 kaspaz-1 aňlatmasyny döredýändigini ýa-da öý eýesiniň NLRP3 çişme täsirini işjeňleşdirmekde rol oýnamak, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin we pcDNA3.1 (+) - alfa -7.3 giardin rekombinant plazmid DNK bilen syçanjygyň peritoneal makrofaglaryna geçirildi we esasy çişme beloklarynyň aňlatma derejesi, lokalizasiýasy we oligomerizasiýasy kesgitlenildi.Bu synagda GEV polo positiveitel gözegçilik topary hökmünde ulanyldy we hiç bir bejeriş topary (diňe PBS) ýa-da pcDNA3.1 (+) transfeksiýa bejeriş topary negatiw topar däldi.Netijeler, GEV toparyndaky ýaly, giardin pcDNA3.1 (+) - alfa-2 we giardin pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 rekombinant plazmid DNK-synyň NLRP3, pro-IL-1β we tertipleşdirilmegine sebäp bolandygyny görkezdi. procaspase-1 we kaspase-1 işjeňleşdirme (2a surat).Mundan başga-da, iki giardin hem möhüm IL-1β sekresiýasyna sebäp boldy (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOWA, F (4, 10) = 1.625, P = 0,0047) (2-nji surat).ASC beloklarynyň köpüsi, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 ýa-da pcDNA3.1 (+) - alfa- tapawutlylykda pcDNA3.1 (+) plazmidi bilen ýokaşan bejeriş toparynda monomerdi. 7.3 giardine.ASC oligomerizasiýasy, oligomer görnüşini görkezýän GEV polo positiveitel gözegçilik toparynyň ýa-da toparyň rekombinant plazmid DNK-synda ýüze çykdy (2-nji surat).Bu deslapky maglumatlar, alfa-2 giardiniň we alfa-7,3 giardiniň NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine sebäp bolup biljekdigini görkezýär.ASC we NLRP3 lokalizasiýasynyň soňraky immunofloresent gözlegleri, otrisatel gözegçilik toparynda ASC belogynyň sitoplazmanyň hemme ýerine ýaýrandygyny we pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin ýa-da pcDNA3 bilen gyjyndyrylanda nokat signaly hökmünde ýüze çykandygyny görkezdi.1 (+) - alfa-7,3 giardin topary ýa-da GEV polo positiveitel gözegçilik topary (2-nji surat).Negativearamaz gözegçilikde we plazmid bilen bejerilen pcDNA 3.1 toparlarynda NLRP3 belok signaly tapylmady, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardine ýa-da pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 jogap hökmünde floresan signal nokady tapylmady tapyldy..giardin sitoplazmada ýa-da HEV gyjyndyrylanda bolýar (2-nji surat).Bu maglumatlar, G. duodenalis giardin alfa-2 we giardin alfa-7.3, syçanjygyň esasy peritoneal makrofaglarynda NLRP3 çişmesini işjeňleşdirýändigini görkezýär.
pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin we pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardin syçanjygyň peritoneal makrofaglarynda NLRP3 çişmesini işjeňleşdirýär.Rekombinant eukariotik aňlatma plazmidi pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin we pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardini esasy murin peritoneal makrofaglara we öýjüklere geçiriň ýa-da aňlatma, oligomerizasiýa derňewi üçin adatdan daşary hadysany 24 sagadyň dowamynda ýygnaň sekresiýasy.we esasy çişiriji beloklaryň lokalizasiýasy.Negativearamaz gözegçilik hökmünde diňe PBS (C) topary we pcDNA3.1 (+) ýeke bejeriş topary ulanyldy, oňyn topar hökmünde GEV bejeriş topary ulanyldy.Günbatar partlamasy bilen NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspase-1 we p20 kaspase-1 ýaly esasy çişiriji beloklar NLRP3 tapyldy.b Adatdan daşary hadysalarda IL-1β bölünip çykma derejeleri ferment bilen baglanyşykly immunosorbent barlagyny (ELISA) ulanmak arkaly kesgitlenildi.Gözegçilik we synag toparlarynyň arasyndaky tapawutlar, SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasyny ulanyp, birtaraplaýyn seljerme (ANOVA) arkaly derňeldi.Asterisks ** P <0.01 we *** P <0,001 toparlarynyň arasyndaky düýpli tapawutlary görkezýär.c Pelletlerdäki ASC oligomerizasiýa derejesi DSS biri-biri bilen baglanyşyk derňewi bilen kesgitlenildi, öýjükli lizatlardaky ASC derejesi bolsa ýük gözegçiligi hökmünde ulanyldy.d Immunofloresensiýa ulanyp, ISC lokalizasiýasyny wizuallaşdyrmak.e Immunofloresensiýa NLRP3-iň lokalizasiýasyny göz öňüne getirmek üçin ulanyldy.ASC, apoptotik spek ýaly belok;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid bilen baglanyşdyrýan oligomerizasiýa meňzeş reseptor 3;ns, ähmiýetli däl (P> 0.05)
G. duodenalis we GEV-leriň ikisi hem NLRP3 çişmesini işjeňleşdirýär we vitroda öý eýesiniň çişme seslerini sazlaýar.Şeýlelik bilen, G. duodenalisiň patogenliginde NLRP3 çişmesiniň roly düşnüksiz bolup galýar.Bu meseläni derňemek üçin, G. duodenalis kistine ýokaşan syçanlar bilen G. duodenalis kist + MCC950 inhibitor bejergisi bilen ýokaşan syçanlaryň arasynda synag geçirdik we G. duodenalis kistasy ýokaşanda NLRP3 çişme aňlatmasyny deňeşdirdik.Synagyň jikme-jik shemasy 3a suratda görkezilýär.Dürli bejeriş toparlarynda syçanlaryň beden agramynyň üýtgemegi kistalar bilen ýokaşandan soň 7 günüň dowamynda gözegçilik edildi we netijeler 3b-nji suratda görkezilýär.Arassa PBS bilen bejerilen topar bilen deňeşdirilende, netijeler (i) G. duodenalis kistasy bilen ýokaşan syçanlaryň beden agramynyň ýokaşandan soň 3-nji günden 7-nji güne çenli azalandygyny görkezdi;(ii) MCC950 inhibitory bilen bejermek, syçanlaryň beden agramyna ep-esli täsir etmedi..Infectioneke-täk ýokaşma topary bilen deňeşdirilende, MCC950 bilen bejerilen on iki barmakly ýokanç toparynyň BW dürli derejelere çenli azaldy (1-nji gün: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; 2-nji gün: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, P <0.0001; (3, 24) = 0.6497, P = 0.0645 günBu maglumatlar, NLRP3 çişmesiniň on iki barmakly ýokançlygyň irki döwürlerinde (2-4 gün) syçanlary ep-esli horlanmakdan goraýandygyny görkezýär.Soňra on iki barmakly lava suwuklygynda G. duodenalis trophozoitleri tapmagy maksat edindik we netijeler 3c-nji suratda görkezilýär.G. on iki barmakly kist ýokanç topary bilen deňeşdirilende, on iki barmakly içege içindäki trofozitleriň sany NLRP3 çişmesini (t (12) = 2.902, P = 0.0133) ýapandan soň ep-esli artdy.Diňe PBS we MCC950 bilen bejerilen negatiw gözegçilik bilen deňeşdirilende, HE bilen reňklenen on iki barmakly dokumalar görkezdi: (i) G. on iki barmakly kist ýokançlygy, on iki barmakly villi zeper ýetmegine sebäp boldy (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) we kriptografiýa atrofiýasy (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis kistalary bilen ýokaşan we MCC950 ingibitorlary bilen bejerilen syçanlardan on iki barmakly içege.on iki barmakly villi zeper ýetdi we öldi (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) atrofiýa we kriptografiki şahasy (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (3d- surat) f).Bu netijeler, NLRP3 çişmesiniň G. duodenalisiň patogenligini azaltmakda rol oýnaýandygyny görkezýär.
Giardia on iki barmakly içege ýokançlygynda NLRP3 çişmesiniň roly.Syçanlar on iki barmakly kist bilen gawasiýa edildi, soň bolsa MCC950 (ip) bilen ýa-da bolmazdan bejerildi.Dolandyryş hökmünde PBS ýa-da MCC950 bilen ýeke bejeriş toparlary ulanyldy.Synag topary we bejeriş tertibi.b Dürli bejeriş toparlarynyň hersinde syçanlaryň beden agramy 7 gün gözegçilik edildi.G. duodenalis ýokanç topary bilen G. duodenalis + MCC950 ýokanç bejeriş toparynyň arasyndaky tapawut, SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasyny ulanyp, synag arkaly seljerildi.Asterisks * P <0.05, ** P <0.01, ýa-da *** P <0,001-de möhüm tapawutlary görkezýär.c Parazitiki ýük on iki barmakly içege suwuklygyndaky trofozitleriň sanyny sanamak arkaly kesgitlenildi.G. duodenalis ýokanç topary bilen G. duodenalis + MCC950 ýokanç bejeriş toparynyň arasyndaky tapawut, SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasyny ulanyp, synag arkaly seljerildi.Asterisks * P <0.05-de möhüm tapawutlary görkezýär.d Gematoksilin we eozin (H&E), on iki barmakly içege gistopatologiýasynyň boýag netijeleri.Gyzyl oklar obanyň zeperlenendigini, ýaşyl oklar bolsa kriptlere zeper ýetendigini görkezýär.Tereziniň çyzgysy: 100 µm.e, f On iki barmakly obanyň beýikliginiň we syçanjygyň beýikliginiň statistik derňewi.Asterisks * P <0.05 we ** P <0.01-de möhüm tapawutlary görkezýär.Netijeler 7 garaşsyz biologiki synagdan alyndy.BW, bedeniň agramy;ig, intragastriki gowşuryş ugry;ip, içerki gowşuryş ugry;ns, ähmiýetli däl (P> 0.05);PBS, fosfat buferli duzly;WT, ýabany görnüş
IL-1β sekresiýasy, çişme işjeňliginiň alamatydyr.G. duodenalis alfa-2 giardiniň we alfa-7.3 giardiniň NLRP3 öý eýesiniň çişmesini işjeňleşdirýändigini ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, bejerilmedik WT syçanlary (ýasama topar) we NLRP3 çişiriji bloklanan syçanlary (MCC950 inhibitirlenen bejeriş topary) ulandyk.Synagyň jikme-jik shemasy 4a-njy suratda görkezilýär.Synag toparlary PBS bilen bejerilen syçanlardan, gawage arkaly G. duodenalis kist bejergisinden, pcDNA3.1 öýjükli sanjymyndan we pcDNA3.1 (+) - öýjükli sanjymdan - alfa-2 giardin ýa-da pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinden ybaratdy.Rekombinant plazmidiň öýjükli administrasiýasyndan 7-nji gün, serum ýygnaldy we her toparda IL-1β derejesi kesgitlenildi.4b suratda görkezilişi ýaly, MOCK toparynda: (i) PBS topary bilen deňeşdirilende, pcDNA3.1 bejergisi IL-1β sekresiýasyna (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998) ep-esli täsir etmedi. G. duodenalis kist toparynda (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardine we pcDNA3-de IL-β sekresiýasy ep-esli ýokarlandy.1- Alfa-7.3 giardine öýjükli sanjym, serum IL-1β derejesini ep-esli ýokarlandyrdy (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);. .MCC950 bejeriş toparyndaky we MOCK toparyndaky her topar bilen deňeşdirilende: (i) PBS gözegçilik toparyndaky we pcDNA3.1 gözegçilik toparyndaky IL-1β sekresiýa derejesi MCC950 inhibitoryny bloklandan soň belli bir derejede azaldy, ýöne tapawut bolmady ähmiýetli (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 petiklenenden soň., G. duodenalis kist ýokaşan toparynda, pcDNA3.1-alfa-2 giardin toparynda we pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine toparynda IL-1β sekresiýasy ep-esli azaldy (G. duodenalis: ANOVA, F (9 , 58) = 3.540, P = 0.0120; pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Bu netijeler, alfa-2 giardiniň we alfa-7.3 giardiniň NLRP3 çişmesiniň wivo bilen işjeňleşmegine araçylyk edýändigini görkezýär.
pcDNA3.1 (+) - giardinler NLRP3 öý eýesiniň çişmesini işjeňleşdirýär.Syçanlar rekombinant eukariotik aňlatma plazma pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin ýa-da pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardine garşy immunizasiýa edildi, soň bolsa MCC950 (ip; MCC950 topary) bilen bejerildi ýa-da ýok ).Oňyn gözegçilik hökmünde PBS ýa-da pcDNA3.1 (+) plazmidi bejermek topary ulanyldy, polo positiveitel gözegçilik hökmünde G. duodenalis kist bejeriş topary ulanyldy.Synag topary we bejeriş tertibi.b Syçanlarda IL-1β serum derejesi 7-nji gün ELISA barlagy bilen ölçenildi.MOCK toparyndaky toparlaryň arasyndaky tapawutlar bir taraplaýyn ANOVA ulanylyp, MOCK topary bilen MCC950 toparynyň arasyndaky tapawutlar SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasynyň synagyndan peýdalanyp seljerildi.Asterisks, MOCK toparyndaky bejeriş toparlarynyň arasynda düýpli tapawutlary görkezýär, * P <0.05 we *** P <0,001;dollar belgileri ($) MOCK toparyndaky her topar bilen P <0.05 derejesinde MCC950 toparynyň arasyndaky düýpli tapawudy görkezýär.Sevenedi garaşsyz biologiki synaglaryň netijeleri.i, öýjükli sanjym, ns, ähmiýetli däl (P> 0.05)
Alfa-2 we alfa-7.3 giardine-mediasiýa işjeňleşmesiniň NLRP3 öýjüginiň G. on iki barmakly ýokançlyga täsirini öwrenmek üçin WT C57BL / 6 syçanjygy ulandyk we alfa-2 giardine we alfa-7.3 giardine sanjym etdik.plazmidi G. duodenalis kistasynyň aşgazan turbasyndan 3 günden soň, öýjükli sanjym edildi, şondan soň syçanlar 7 gün gözegçilik edildi.Synagyň jikme-jik shemasy 5a suratda görkezilýär.Her syçanjygyň beden agramy her gün ölçelýärdi, täze on iki barmakly dokumanyň nusgalary aşgazan turbasynyň üsti bilen kabul edilenden 7-nji günde ýygnaldy, trofozitleriň sany ölçeldi we gistopatologiki üýtgeşmeler hasaba alyndy.5b suratda görkezilişi ýaly, iýmitleniş wagtynyň köpelmegi bilen her topardaky syçanlaryň BW kem-kemden köpeldi.Syçanlaryň MT-si G. duodenalis kistalarynyň intragastriki administrasiýasyndan soň 3-nji gün peselip başlady we soňra kem-kemden köpeldi.Alfa-2 giardine we alfa7.3 giardine öýjükli sanjym netijesinde dörän NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegi, syçanlarda agramy ep-esli ýokarlandyrdy (1-nji gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 1-nji gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 1.399, P = 0.9987 2-nji gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.9979 2-nji gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 3-nji gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA, F (; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 3-nji gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardine, ANOVA , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, 4-nji gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.5620, P <0.0001, 5-nji gün: pcDNA3.1-alfa - 2 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 5-nji gün: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 6-njy gün: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, 6-njy gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7-nji gün: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.5369, P <0.0001 7-nji gün: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOWA, F (4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Parazitiki ýük on iki barmakly içegede bahalandyryldy (5-nji surat).Bejerilmedik polo positiveitel gözegçilik we boş pcDNA3.1 wektoryna sanjym edilen topar bilen deňeşdirilende, α-2 giardine we α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alfa) sanjym edilen toparlarda G. duodenalis trofozitleriniň sany ep-esli azaldy. -2 giardine: ANOWA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOWA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Mundan başga-da, giardine alfa-7.3 syçanlarda giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081) has goraglydy.HE boýagynyň netijeleri injirde görkezilýär.5d - f.Alfa-2 giardine we alfa-7.3 giardine sanjym edilen syçanlar, on iki barmakly dokumanyň zeperlenmelerine eýe bolup, G. on iki barmakly sanjym edilen syçanlar we boş pcDNA3 wektory bilen utgaşdyrylan G. duodenalis bilen sanjym edilen syçanlar bilen deňeşdirilende az bolýar.. = 0.0028 ýa-da P = 0.0055) we peseldilen kriptografiýa (pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 ýa-da P = 0.0158; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA , F (3, 24) = 1.470, P = 0.0371 ýa-da P = 0.0191).Bu netijeler, alfa-2 giardiniň we alfa-7,3 giardiniň, NLRP3 çişmesini wivo işjeňleşdirmek arkaly G. duodenalisiň ýokançlygyny azaldýandygyny görkezýär.
PcDNA3.1 (+) - G. duodenalis ýokançlygyndaky giardinleriň roly.Syçanlar rekombinant eukariotik aňlatma plazmidi pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardine ýa-da pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardine garşy immunizasiýa edildi, soň bolsa G. duodenalis kistalary (ig) bilen garşylandy.Negativearamaz gözegçilik toparlary hökmünde PBS topary we pcDNA3.1 (+) + on iki barmakly kist bejeriş topary ulanyldy, on iki barmakly kist bejeriş topary oňyn gözegçilik topary hökmünde ulanyldy.Synag topary we bejeriş tertibi.b Dürli bejeriş toparlarynyň hersinde syçanlaryň MT-si synagdan soňky 7 günüň dowamynda gözegçilik edildi.Asterisks G. duodenalis toparyndaky toparlar bilen pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin topary, * P <0.05, ** P <0.01, we *** P <0,001;dollar belgisi ($) G. duodenalisiň her topary bilen pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 ardardin topary, $$ P <0.01 we $$$ P <0,001 arasynda düýpli tapawudy görkezýär.c Parazitiki ýük, on iki barmakly içegeden (uzynlygy 3 sm) 1 ml on iki barmakly içegede trofozitleriň sanyny sanamak arkaly kesgitlenildi we on iki barmakly içege üçin parazitleriň sany hökmünde görkezildi.G. duodenalis ýokanç topary, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin topary bilen pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardine toparynyň arasyndaky tapawutlar, SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasyny ulanyp, bir taraplaýyn ANOVA tarapyndan seljerildi.Asterisks ** P <0.01 we *** P <0,001-de möhüm tapawutlary görkezýär.d On iki barmakly içegäniň histopatologiki üýtgemeleri.Gyzyl oklar obanyň zeperlenendigini, ýaşyl oklar bolsa kriptlere zeper ýetendigini görkezýär.Tereziniň çyzgysy: 100 µm.e, f Syçanjygyň on iki barmakly villus beýikliginiň (e) we kriptografiki beýikliginiň (f) statistik derňewi.1d suratdaky toparlaryň arasyndaky tapawutlar, SPSS programma üpjünçiliginiň 22.0 wersiýasyny ulanyp, bir taraplaýyn ANOVA tarapyndan derňeldi.Asterisks * P <0.05 we ** P <0.01-de möhüm tapawutlary görkezýär.Sevenedi garaşsyz biologiki synaglaryň netijeleri.ns, ähmiýetli däl (P> 0.05)
Giardia on iki barmakly içege, giardiaz keseline sebäp bolýan beýleki içege parazitidir.2004-nji ýylda, esasanam pes sosial-ykdysady ýagdaýy bolan jemgyýetlerde 6 ýyldan bäri ýaýramagy sebäpli BSGG-ny äsgermezlik edýän keseller inisiatiwasyna girizildi [32].Dogabitdi immun ulgamy G. duodenalis ýokançlygyna garşy immunitetde möhüm rol oýnaýar.Syçan makrofaglarynyň, öýjükli duzaklary boşadyp, G. duodenalisiň gurşap alýandygy we öldürilendigi habar berildi [33].Öňki gözleglerimiz, invaziv däl öýjükli parazit G. duodenalisiň, öýjügiň çişme seslerini sazlamak üçin syçanjygyň makrofaglarynda p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 we NLRP3 çişiriji signalizasiýa ýollaryny işjeňleşdirýändigini we GEV goýberilendigini görkezdi.13], 24].Şeýle-de bolsa, GEV-de NLRP3 çişme bilen kadalaşdyrylan çişmä gatnaşýan takyk PAMP-ler we giardiazda NLRP3 çişmesiniň roly entek düşündirilmeli.Bu iki soraga düşünmek üçin bu barlagy geçirdik.
NLRP3 çişmesi immun öýjükleriniň sitoplazmasynda ýerleşýär we peşew kislotasynyň kristallary, toksinler, bakteriýalar, wiruslar we parazitler ýaly dürli bölejikler tarapyndan işjeňleşdirilip bilner.Bakteriýa gözleglerinde, toksinler çişme datçiklerini işjeňleşdirýän, çişmä we öýjük ölümine sebäp bolýan esasy PAMP hökmünde kesgitlenildi [34].Käbir gurluş taýdan dürli toksinler, mysal üçin Stafilokokk aureusyndan gemolizin [35] we Escherichia coli [36], enterotoksinden (NHE) [37] gemolizin BL (HBL) NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine sebäp bolýar.Wirus gözlegleri, SARS-COV-2 konwert (E) belok [38] we Zika wirusy NS5 belogy [39] ýaly wirusly beloklaryň NLRP3 reseptory tarapyndan ykrar edilen möhüm PAMP-lerdigini görkezdi.Parazit gözleglerinde, köp parazitleriň Toksoplazma gondii, Trihomonas waginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] we Leishmania [42] ýaly öýken çişme işjeňleşmesi bilen baglanyşyklydygy habar berildi.Toksoplazma gondi wirusynyň wirusy bilen baglanyşykly GRA35, GRA42 we GRA43 dykyz granula beloklary, Lewis rat makrofaglarynda piroptozyň induksiýasy üçin zerurdyr [43].Mundan başga-da, Leýşmaniýanyň käbir gözlegleri, parazit membranasynyň lipofosfoglikan [44] ýa-da sink metalloproteaz [45] ýaly NLRP3 çişmesine gatnaşýan aýry molekulalara gönükdirildi.Aneksine meňzeş alfa-giardin genler maşgalasynyň arasynda alfa-1 giardin, syçanyň modelinde G. duodenalisden goramagy üpjün edýän sanjym kandidatydygy görkezildi [18].Geçirilen işimizde, giardiýa mahsus, ýöne az habar berilýän G. duodenalis wirus faktorlaryny alfa-2 we alfa-7,3 giardini saýladyk.Bu iki maksatly gen, çişme işjeňleşmesini seljermek üçin pcDNA3.1 (+) eukariotik aňlatma ulgamy wektoryna klonlaşdyryldy.
Syçanjygymyzyň modelinde, ýapylan kaspaz bölekleri çişme işjeňleşmesiniň alamaty bolup hyzmat edýär.Gyjyndyrmadan soň, NLRP3 ASC bilen aragatnaşyk saklaýar, prokasplary işe alýar we pro-IL-1β we pro-IL-18-i degişlilikde -18 ýetişen IL-1β we IL-18-e bölýän işjeň kassalary döredýär.Lamokançly kasasalar (kaspazlar-1, -4, -5 we -11), dogabitdi gorag üçin möhüm ähmiýete eýe bolan we çişme we programmirlenen öýjük ölümine gatnaşýan sistein proteizleriniň goralýan maşgalasydyr [46].Kaspase-1 kanoniki çişme bilen işjeňleşdirilýär [47], atipiki ýokançlyklar emele gelende 4, -5 we -11 kasplar ýapylýar [48].Bu gözlegde, syçanjygyň peritoneal makrofaglaryny nusga hökmünde ulandyk we G. duodenalis ýokançlygyny öwrenmekde öý eýesi NLRP3 çişmeginiň işjeňleşmeginiň alamaty hökmünde p20 kaspase-1 ýapylan kaspaz-1-i derňedik.Netijeler, bakteriýalara we wiruslara gatnaşýan esasy wirus molekulalarynyň tapylmagyna laýyk gelýän çişmegiň adaty işjeňleşmegine köp alfa-giardiniň jogapkärdigini görkezdi.Şeýle-de bolsa, biziň gözlegimiz diňe deslapky ekrandyr we klassiki däl çişmelerini işjeňleşdirip biljek beýleki molekulalar bar, sebäbi öňki gözlegimiz G. duodenalis ýokançlygynda klassiki we klassiki däl ylhamlary tapdy [13].Döredilen p20 kaspaz-1-iň NLRP3 çişmesi bilen baglanyşyklydygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, alfa-2 we alfa-7.3 giardinlerini esasy molekulanyň belok derejesini we ASC oligomerizasiýa derejesini kesgitlemek üçin alfa-2 we alfa-7.3 giardinleri geçirdik. çişiriji NLRP3.Netijelerimiz, “Maco-Pryhoda” we başgalaryň netijelerinden birneme tapawutlanýar, “Caco-2” öýjükleriniň diňe G. muris ýa-da E. coli EPEC ştamlary bilen gyjyndyrylmagynyň NLRP3, ASC we kasp-1, floresan intensiwligini ýokarlandyryp biljekdigini habar berdi. ep-esli bolmasa-da, G. muris bilen E. coliniň bahasy üç belok derejesini ýokarlandyrdy [49].Bu gapma-garşylyk, Giardia görnüşlerini, öýjük çyzyklaryny we esasy öýjükleri saýlamagyň tapawudy sebäpli bolup biler.Şeýle hem, G. duodenalise has ýygy duş gelýän 5 hepdelik aýal WT C57BL / 6 syçanjygynda MCC950 ulanyp, wivo barlaglarynda ýerine ýetirdik.MCC950, nanomolar konsentrasiýalarynda kanoniki we kanon däl NLRP3 işjeňleşmesini bökdeýän güýçli we saýlama ownuk molekula NLRP3 inhibitorydyr.MCC950 NLRP3 işjeňleşdirmesini saklaýar, ýöne AIM2, NLRC4 we NLRP1 çişme ýollarynyň ýa-da TLR signalizasiýa ýollarynyň işjeňleşmegine täsir etmeýär [27].MCC950 NLRP3 işjeňleşdirmesini bloklaýar, ýöne NLRP3 başlangyjyny, K + efflux, Ca2 + akymyny ýa-da NLRP3 bilen ASC-iň täsirini päsgel bermeýär;tersine, ASC oligomerizasiýasynyň öňüni alyp, NLRP3 çişme işjeňleşmesini saklaýar [27].Şol sebäpden, giardin sanjymyndan soň NLRP3 çişmesiniň roluny kesgitlemek üçin wivo gözleginde MCC950 ulandyk.Işjeňleşdirilen kasp-1 p10, çişmä garşy sitokinleri pro-IL-1β we pro-IL-18 ýetişen IL-1β we IL-18 [50] bilen bölýär.Bu gözlegde, MCC950 bilen ýa-da bolmasa, giardin bilen bejerilen syçanlarda serum IL-1β derejesi, NLRP3 çişmesiniň işjeňleşendigini ýa-da ýokdugyny görkezmek üçin ulanyldy.Garaşylyşy ýaly, MCC950 bejergisi serum IL-1β derejesini ep-esli azaldy.Bu maglumatlar, G. duodenalis giardin alfa-2 we giardin alfa-7.3, NLRP3 syçanjygyň çişmesini işjeňleşdirip biljekdigini aýdyň görkezýär.
Soňky on ýylda toplanan möhüm maglumatlar, IL-17A-nyň G. murise garşy immunitetiň esasy düzgünleşdirijisidigini, IL-17RA duýduryşyny döredip, mikroblara garşy peptidleri öndürýändigini we goşmaça işjeňleşmegi kadalaşdyrýandygyny görkezdi [51].Şeýle-de bolsa, Giardia infeksiýasy ýaş ulularda ýygy-ýygydan ýüze çykýar we ýaş syçanlardaky Giardia infeksiýasynyň gorag täsirini ulanmak üçin IL-17A jogabyny işjeňleşdirmeýändigi, gözlegçileriň beýleki immunomodulýator Giardia gözlemegine sebäp bolandygy habar berildi.helmint ýokançlygynyň mehanizmleri.Aakynda geçirilen gözlegiň awtorlary, G. murisiň mikroblara garşy peptidleriň öndürilmegine kömek edýän we içege ýolundaky trofozitleriň sanyny azaldýan E. coli EPEC tarapyndan NLRP3 çişmesini işjeňleşdirip biljekdigini habar berdiler. bakilli sebäpli döreýän keseller [49].NLRP3 çişmesi dürli keselleriň ösmegine gatnaşýar.Geçirilen gözlegler, Pseudomonas aeruginosa-nyň öýjük ölüminden gaça durmak üçin makrofaglarda autofagy döredýändigini görkezdi we bu amal NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine baglydyr [53].N. kanin üçin, NLRP3 çişmesiniň reaktiw kislorod görnüşleriniň töwekgelçilikli işjeňleşmegi, öý eýesiniň köpelmegini çäklendirýär we potensial bejeriş maksadyna öwürýär [9].Paracoccidioides brasiliensis, NLRP3 çişmesiniň syçan süňkünden ýasalan dendrit öýjüklerinde işjeňleşmegine itergi berýän tapyldy, netijede öý goragynda möhüm rol oýnaýan IL-1β çişiriji sitokiniň bölünip çykmagyna sebäp boldy [10].Leýşmaniýanyň birnäçe görnüşi, şol sanda L. amazonensis, L. maýor, L. braziliensis we L. infantum chagasi, makrofaglarda NLRP3 we ASC garaşly kasp-1 işjeňleşdirýär, şeýle hem Leýşmaniýa ýokançlygy.Parazitleriň köpelmegi NLRP3 / ASC / kaspase-1 geninde syçanlar ýetmezçiliginde güýçlendirilýär [11].Zamboni we başgalar.Leýşmaniýa ýokançlygynyň, öýjükli parazitleriň köpelmegini çäklendirýän makrofaglarda NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegine sebäp bolýandygy habar berildi.Şeýlelik bilen, Leýşmaniýa öňüni alyş strategiýasy hökmünde NLRP3 işjeňleşdirmesini saklap biler.“Vivo” gözleglerinde NLRP3 çişmesi Leýşmaniýanyň ýok edilmegine goşant goşdy, ýöne dokumalara täsir etmedi [54].Munuň tersine, helmintiaz barlaglarynda NLRP3 çişmesiniň işjeňleşmegi, öý eýesiniň aşgazan-içege helmintiazyna garşy gorag immunitetini basyp ýatyrdy [12].Şigella bütin dünýäde içgeçmä sebäp bolýan esasy bakteriýalardan biridir.Bu bakteriýalar, P2X7 reseptor-araçylyk K + effluks, reaktiw kislorod görnüşleri, lizozom kislotasy we mitokondrial zeper arkaly IL-1β önümçiligine itergi berip biler.NLRP3 çişmesi, fagositozy we makrofaglaryň Şigella garşy bakterisid işjeňligini negatiw kadalaşdyrýar [55].Plazmodium gözlegleri, AIM2, NLRP3 ýa-da plazmody ýokaşan kaspaz-1 ýetmezçilikli syçanlaryň ýokary derejeli 1 interferon öndürýändigini we Plazmodium ýokançlygyna has çydamlydygyny görkezdi [56].Şeýle-de bolsa, syçanlarda NLRP3 çişmesiniň patogen işjeňleşmegine itergi bermekde alfa-2 giardiniň we alfa-7.3 giardiniň roly düşnüksiz.
Bu gözlegde, MCC950 tarapyndan NLRP3 çişmesiniň gadagan edilmegi BW-ni azaltdy we syçanlardaky içege lava suwuklygyndaky trofozitleriň sanyny köpeltdi, netijede on iki barmakly dokumada has agyr patologiki üýtgemeler ýüze çykdy.Alfa-2 giardine we alfa-7.3 giardine, öý eýesi NLRP3 çişmesini işjeňleşdirýär, syçanjygyň bedeniniň agramyny ýokarlandyrýar, içege lava suwuklygyndaky trofozitleriň sanyny azaldýar we on iki barmakly on iki barmakly şikesleri ýeňilleşdirýär.Bu netijeler, G. duodenalisiň NLRP3 öý eýesini alfa-2 giardin we alfa-7,3 giardin arkaly işjeňleşdirip, G. duodenalisiň syçanlardaky patogenligini peseldip biljekdigini görkezýär.
Köpçülikleýin netijelerimiz, alfa-2 we alfa-7.3 giardinleriniň NLRP3 öýjüginiň çişmegine itergi berýändigini we G. duodenalisiň syçanlarda ýokançlygyny peseldýändigini görkezýär.Şonuň üçin bu molekulalar giardiazyň öňüni almak üçin geljegi uly maksatdyr.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: umumy syn.“Pat Inflamm” -yň neşe serişdelerine allergiýasy barlygy ýaňy-ýakynda ýüze çykaryldy.2019; 13: 134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapiýa syn.Dermanhananyň ekspert pikiri.2007;8: 1885–902.
Týan Huafeng, Çen Bin, Wen Jianfeng.Giardiaz, neşe garşylygy we täze maksatlaryň tapylmagy.Ectsokançlyklar Derman nyşanlaryny bozýar.2010; 10: 295–302.
Wang Z, Zhang X, Sýao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T we ş.m. NLRP3 çişme we çiş keselleri.Oksid Med öýjük Longew.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Içegäniň çişmeginde we düwnük keselinde ýokançlygyň roly.Gastroenterologiýa.2011;141: 1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Immun çydamlylygynyň we içegäniň çişmeginiň çatrygynda kanoniki we atipik NLRP3 çişme işjeňleşmesi.immunitetden öň.2017; 8: 36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S we ş.m.N. kanin ýokançlygyna garşy ROS-töwellaçylykly NLRP3 çişme işjeňleşmesi gatnaşýar.Parazit wektory.2020; 13: 449.